免疫熒光檢查

免疫熒光檢查概述

免疫熒光檢查(immunofluorescence exa分鐘ation)是將熒光素與抗體連接成熒光抗體,再與待檢標本中的抗原反應,將反應物置熒光顯微鏡下觀察抗原抗體複合物散髮的熒光,藉此對標本中的抗原進行鑒定和定位。

免疫熒光檢查原理

免疫學方法(抗原抗體特異結合)與熒光標記技術結合,檢查特異蛋白抗原在組織或細胞內分佈的方法。由於熒光素所發的熒光可在熒光顯微鏡下檢出,從而可對抗原進行細胞定位。

免疫熒光檢查檢查方法

免疫熒光檢查可分直接法、間接法、夾心法和補體法。
1. 直接法
將標記的特異性熒光抗體,直接加在抗原標本上,經一定的溫度和時間的染色,用水洗去未參加反應的多餘熒光抗體,室溫下乾燥後封片、鏡檢。
(1)滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS於待檢標本片上,10分鐘後棄去,使標本保持一定濕度。
(2)滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液,使其完全覆蓋標本,置於有蓋搪瓷盒內,保溫一定時間(參考:30分鐘)。
(3) 取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS沖洗後,再按順序經過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3~5 分鐘,不時振蕩。
(4)取出玻片,用濾紙吸去多餘水分,但不使標本乾燥,加一滴緩衝甘油,以蓋玻片覆蓋。
(5)立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度來判斷免疫複合物的多少,常用半定量法,(-)陰性,無熒光;(±)高倍鏡下似乎可見;(+)低倍鏡下似乎可見,高倍鏡下明顯可見;(++)低倍鏡下明顯可見,高倍鏡下清晰可見;(+++)低倍鏡下清晰可見,高倍鏡下耀眼;(++++)低倍鏡下耀眼,高倍鏡下刺眼。
2. 間接法
如檢查未知抗原,先用已知未標記的特異抗體(第一抗體)與抗原標本進行反應,用水洗去未反應的抗體,再用標記的抗抗體(第二抗體)與抗原標本反應,使之形成抗原—抗體—抗體複合物,再用水洗去未反應的標記抗體,乾燥、封片後鏡檢。如果檢查未知抗體,則表明抗原標本是已知的,待檢血清為第一抗體,其它步驟的抗原檢查相同。
(1)滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS於已知抗原標本片,10分鐘後棄去,使標本片保持一定濕度。
(2)滴加以0.01mol/L,pH7.4的PBS適當稀釋的待檢抗體標本,覆蓋已知抗原標本片。將玻片置於有蓋搪瓷盒內,37℃保溫30分鐘。
(3)取出玻片,置於玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS沖洗1~2次,然後按順序過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸5分鐘,不時振蕩。
(4)取出玻片,用濾紙吸去多餘水分,但不使標本乾燥,滴加一滴一定稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體。
(5)將玻片平放在有蓋搪瓷盒內,37℃保溫30分鐘。
(6)重覆操作步驟(3)。
(7)取出玻片,用濾紙吸去多餘水分,滴加一滴緩衝甘油,再覆以蓋玻片。
(8)熒光顯微鏡高倍視野下觀察,結果判定同直接法。

免疫熒光檢查臨床意義

1.直接法
(1)細胞間熒光提示天皰瘡
(2)基底膜熒光帶:在系統性紅斑狼瘡盤狀紅斑狼瘡的皮損,均可見顆粒狀的以IgG為主的帶狀分佈。在類天皰瘡為線狀的以IgG為主的帶狀分佈。
(3)在真皮內血管壁見到圈狀熒光提示血管炎
2.間接法
抗核抗體陽性可見於以下疾病。
(1)風濕性結締組織病紅斑狼瘡硬皮病乾燥綜合徵、類風濕性關節炎等。
(2)增生性疾病:高球蛋白血症性紫癜、巨球蛋白血症、淋巴瘤慢性白血病、癌腫等。
(3)感染性疾病:結核病、瘤型麻風、組織胞漿菌病
抗核抗體本身並非特異,滴度和核型對診斷也有重要參考價值。因此除定性外,還應結合滴度、核型及臨床體徵才具有較大價值。
3.補體結合法
常用來檢測患者的自身抗體,如妊娠皰疹患者。